Centro Servizi di Ateneo per la Ricerca (CeSAR)
Biosensore SPR Biacore X100
La Risonanza Plasmonica di Superficie è una tecnica che consente di misurare in tempo reale le interazioni biomolecolari con elevata sensibilità, ed in assenza di traccianti potenzialmente invasivi, quali le sonde fluorescenti. È in grado di fornire informazioni qualitative e quantitative su specificità, cinetica ed affinità. È applicabile allo studio di qualsiasi tipo d’interazione tra molecole d’interesse biologico, quali proteine, acidi nucleici, carboidrati, lipidi ed anche piccole molecole organiche.
Un biosensore è costituito da un supporto di vetro coperto da lamina d’oro a cui è legato covalentemente uno strato di destrano. Uno degli interagenti (ligando) viene immobilizzato sulla superficie di destrano e l’altro interagente (analita) viene fatto fluire sulla superficie. Quando vi è interazione fra ligando e analita, si ha una variazione dell’indice di rifrazione che viene rilevata dallo strumento come variazione dell’angolo di risonanza. Il segnale SPR misurato in funzione del tempo viene riportato in un sensor-gramma dove si può osservare il cambiamento di indice di rifrazione, mentre l’analita interagisce con il ligando e successivamente si dissocia dalla superficie.
L'interazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento), è alla base del corretto funzionamento di un biosensore, grazie all'utilizzo di macromolecole immobilizzate di riconoscimento integrate in un sistema di trasduzione del segnale fisico. Questo segnale deriva dall’interazione specifica fra la specie ricercata (analita target) e l’elemento sensibile stesso. Il meccanismo di rilevazione è basato su quello delle molecole adsorbenti che causano variazioni nell’indice locale di rifrazione, mutando le condizioni di risonanza delle onde plasmoniche di superficie.
Descrizione e ambiti applicativi
Il Biosensore a Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) Biacore X100, Cytiva, basandosi su una tecnica analitica ottica, permette analisi automatizzate di interazioni tra biomolecole in tempo reale, senza la necessità che queste siano marcate. Biacore X100 è in grado di analizzare campioni (proteine, DNA, RNA, anticorpi, polisaccaridi, lipidi, cellule, etc.) a basso peso molecolare (piccole molecole <100Da), in vari ambienti: tamponi salini anche contenenti dimetilsolfossido (DMSO), in plasma e in sierologia di campioni analizzabili che va da molecole a basso peso molecolare fino a proteine ad elevato peso molecolare in vari ambienti di campioni (tamponi, plasma, siero, etc).
La molecola ligando può essere legata covalentemente ai chip sensori utilizzando diverse chimiche di attivazione (coupling aminico, tiolico, aldeidico) in modo da sfruttare le proprietà chimico-fisiche della stessa e rispettando i requisiti per l'interazione con l'analita.
I vantaggi della tecnica SPR per lo studio delle interazioni biomolecolari sono numerosi:
- Semplice e veloce utilizzo dell'apparecchiatura.
- Marcatura non necessaria delle molecole che interagiscono fra loro.
- Consente di determinare le costanti cinetiche e di affinità, anche per interazioni deboli.
- Informazioni stechiometriche e termodinamiche.
- Monitoraggio in tempo reale del legame fra le specie in questione (rispetto ad ELISA, RIA, cromatografia di affinità e spettroscopia)
- Protocolli con meno fasi, che quindi hanno meno punti critici.
- Lunga durata delle superfici "sensibilizzate" che possono essere riutilizzate per più analisi, qualora la procedura non causi la distruzione di legante e/o ligando
Specifiche tecniche
Due celle di flusso per una tecnica analitica ed elevata sensibilità strumentale con utilizzo di quantità minime di volumi di campione.
Intervallo indice di rifrazione del campione: 1.33-1.40 con un disturbo e deriva della linea di base inferiori a 0.1 RU e 0.3 RU/min.
Temperatura di analisi: 4-40°C.
Degasaggio del campione e sottrazione della reference.
Tempi d’analisi: per ogni ciclo è tra i 2 e i 15 minuti per campione.
Per maggiori informazioni: cesar@unica.it