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Il modulo di Biochimica Applicata si propone di fornire agli studenti le basi teoriche delle diverse metodologie per la purificazione delle macromolecole biologiche e per la loro caratterizzazione strutturale e funzionale, con particolare riferimento alle strategie applicate allo studio delle proteine. Dall’AA 2012-2013 il modulo di Biochimica Applicata prevede 1 CFU di laboratorio (frequenza obbligatoria). Durante le attività di laboratorio gli studenti applicheranno le tecniche cromatografiche, elettroforetiche, spettrofotometriche, oggetto delle lezioni teoriche per la caratterizzazione di macromolecole di interesse biologico. Sono previste 2 esercitazioni in laboratorio informatico per utilizzare un software di simulazione delle purificazione delle proteine che permetterà un confronto e un’analisi critica delle problematiche relative alle diverse tecniche di separazione e analisi. La verifica in itinere consiste in una relazione scritta che ogni studente dovrà redigere sui vari passaggi di purificazione utilizzati durante la purificazione di una data proteina utilizzando il software di simulazione della purificazione delle proteine

PROGRAMMA del Modulo di Biochimica Applicata (CTF)  II anno, II semestre, 5 CFU, AA 2016-2017

Strategie per la purificazione delle proteine. Tecniche preparative e tecniche analitiche. Procedure basate sulla solubilità differenziale di proteine: salting out, precipitazione con solventi organici, precipitazione isoelettrica. Dialisi.
Fotometria e Spettrofotometria UV/VIS: Assorbanza e trasmittanza. Fotometri e spettrofotometri (a singolo raggio, a doppio raggio, a fotodiodi): caratteristiche e principi di funzionamento.Determinazione qualitativa e quantitativa. Metodi di determinazione della concentrazione delle proteine: Metodo di Bradford. Determinazione dell’attività enzimatica.
Fluorimetria: Analisi in fluorescenza. Spettrofluorimetro: caratteristiche e principi di funzionamento. Determinazione qualitativa e quantitativa
Tecniche cromatografiche: principi generali. Matrici, fasi stazionarie e fasi mobili nei diversi tipi di cromatografia. Sistemi cromatografici a bassa pressione su colonna: cromatografia a scambio ionico, cromatografia ad esclusione molecolare, cromatografia per interazioni idrofobiche,cromatografia di affinità. Sistemi cromatografici ad alta pressione (HPLC): cromatografia in fase inversa.
Tecniche elettroforetiche: principi generali. Elettroforesi zonale: apparecchi per i diversi supporti utilizzati (cellulosa, acetato di cellulosa, gel di poliacrilamide e gel di agarosio). Elettroforesi diproteine su gel di poliacrilamide in condizioni native, elettroforesi denaturante in presenza di sodiododecilsolfato (SDS-PAGE), elettroforesi discontinua ed elettroforesi in gradiente di T. Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi bidimensionale. Rivelazione colorimetrica mediante Coomassie Brillant Blue. Elettroforesi su gel di agarosio: caratteristiche, apparecchi e applicazioni. Western blot.
Purificazione delle proteine: considerazioni generali. Monitoraggio del processo di purificazione mediante determinazione del contenuto totale di proteine, saggi dell’attività enzimatica, determinazione di attività specifica, fattore di purificazione e resa. Utilizzo di un software didattico di simulazione della purificazione di proteine.

Caratterizzazione delle proteine: Determinazione del PM delle proteine mediante mediante cromatografia per gel filtrazione ed elettroforesi in SDS. Determinazione del punto isoelettrico delle proteine mediante isoelettrofocalizzazione. Determinazione della composizione aminoacidica delle proteine: metodi e reazioni. Analizzatore di aminoacidi. Determinazione dell’amminoacido N- e C- terminale.Determinazione della sequenza primaria delle proteine: metodi chimici ed enzimatici.

Libro di Testo Consigliato: M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo, Metodologie Biochimiche. Casa Editrice Ambrosiana, 2012

Altro testo da consultare per specifici argomenti: M. Stoppini, V. Bellotti. Biochimica applicata EdiSES  2012

 Propedeuticità: Biologia Animale e Biologia Vegetale, Chimica Organica 1